· poliacrilammideil gel deve essere costituito da monomero di acrilammide, materiale di partenza per la polimerizzazione, catalizzatore e miscela di sale e tampone insieme.
· acrilammidee BIS (N, N'-metilene doppia acrilammide) è la matrice di gel in forma monomerica.
· Processo di polimerizzazione dell'adesivo con persolfato di ammonio. La formulazione della colla richiede una soluzione di persolfato di ammonio al 10% preparata in acqua. La maggior parte delle informazioni indicava la necessità di un uso attivo. Tuttavia, la soluzione al 10% può essere mantenuta a 4°C per diverse settimane senza una significativa perdita di attività. Preparare fino a 10 ml e scartare quando la colla non si aggrega.
Suggerimento: la percentuale diacrilammideNel sequenziamento, la colla e la colla proteica non sono la stessa cosa. Se si utilizza una soluzione pre-confezionata di acrilammide: BIS, assicurarsi di scegliere la confezione giusta.
· TEMED (N, N, N', N'-tetrametil etilendiammina) è un catalizzatore, in una bottiglia marrone, conservata in frigorifero. Aggiungere poco prima di versare la colla.
· Il vetro utilizzato per l'elettroforesi in poliacrilammide deve essere lavato prima e dopo ogni elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, lavare con una spazzola morbida e un panno in acqua calda e sapone, risciacquare con acqua distillata e lasciare asciugare.
· Umidità e polvere possono causare problemi con i polimeri cavi. Prima dell'elettroforesi, pulire la lastra di vetro con un detergente per vetri e strofinarla con una spazzola morbida. Lavare con acqua distillata e asciugare accuratamente con un panno di carta. Risciacquare con etanolo al 70% prima di passare la carta aiuta a pulire e ad accelerare l'asciugatura. Aggiungere i campioni di acrilammide in successione: BIS, acqua, soluzione tampone, persolfato di ammonio, TEMED. Agitare bene e versare immediatamente.
Non è necessario degassare la poliacrilammide prima della polimerizzazione. (In passato, l'acrilammide veniva posta sotto vuoto per rimuovere le bolle, poiché l'ossigeno inibisce la polimerizzazione.)
Suggerimenti per campioni di punti di colla orizzontali.
· Metti un pezzo di carta nera nella scatola in basso, con sfondo nero, per creare un foro campione e vedere più chiaramente.
· tampone riempito con il serbatoio della colla, appena sopra il colloide.
· Se il bordo è illuminato, accendere le luci e lasciare che la luce illumini il colloide. Aspirare il campione nella pipetta.
· utilizzando un dispositivo di pipettaggio automatico.
· in 10-200 μl, un punto di movimento liquido può essere utilizzato nella maggior parte dei punti del campione. Per fori del campione molto piccoli (inferiori a 10 μl), la testa lunga della pipetta utilizzata per la colla di sequenziamento è più pratica.
· pipettando appena immersi nel campione, inalando il fluido in lento movimento. Il campione potrebbe apparire appiccicoso a causa della glicerina e un pompaggio rapido potrebbe far entrare bolle d'aria nella testa della pipetta.
· Dopo l'inalazione dei campioni, la testa del liquido si muoverà delicatamente sul bordo del tubo o la carta assorbente aspirerà la testa del liquido all'esterno delle goccioline. Fare attenzione a non aspirare il campione.
Posizionare il campione nel foro del campione
· dispositivo di pipettaggio per mantenere una leggera pressione, far muovere leggermente i campioni fino a far traboccare la testa del liquido.
· la testa di pipettaggio inserita nel tampone, leggermente più in alto rispetto ai fori di prelievo, mantiene una pressione positiva. La punta della pipetta può essere inserita in un piccolo foro.
· Estrarre lentamente e costantemente i campioni. Posizionare la punta della pipetta sopra il foro del campione e il campione affonderà nel foro. Lasciare che il campione affondi per riempire il foro invece di spingerlo.
· una volta che l'ultima goccia di campione ha raggiunto la testa liquida, il liquido si sposterà nella seconda gamba, sollevando lentamente il liquido, esce dal tampone
Come effettuare il campionamento verticale della colla?
· fori verticali per il campione di colla formati tra due lastre di vetro. Con una colla molto liquida, la testa della pipetta non può nemmeno essere inserita tra due lastre di vetro. Attenzione alla glicerina! Posizionate la testa della pipetta sopra il foro del campione e il campione affonderà nel foro.
· Prima di prelevare il campione, assicurarsi di posizionare il punto verticale del foro del campione in gel di polipropilene acile e di sciacquarlo accuratamente. Lavare via l'acrilammide non polimerizzata e l'acqua che potrebbe accumularsi sul fondo del foro del campione. L'acqua può ridurre significativamente il foro del campione. Utilizzare una siringa da 25 ml o 50 ml e un ago da 18 gauge. Versare il tampone per elettroforesi e sciacquare accuratamente il foro del campione.
· Può essere difficile vedere il foro del campione, ma allo stesso tempo il resto è facile. Se ci sono fori in eccesso, il tampone del campione può essere testato con blu di bromofenolo.
Data di pubblicazione: 31 marzo 2023